商品屬性：

本試劑盒采用裂解液，可快速可靠的從病毒液樣本中純化出高純度的總 RNA。該試劑盒是目前國際上操作步驟最少、用時最短的病毒 RNA 提取試劑盒（僅需要 5 分鐘）。應用本試劑盒提取的 RNA 可直接用于反轉錄、基因克隆、定量 PCR 檢測等多種分子生物學實驗。
注意事項：
(1) 本試劑盒中的 Washing Buffer 中已經加乙醇，無需單獨添加。
(2) RNA LB1 和 RNA BB2 均具有腐蝕性，注意防護。
操作方法
（1）裂解/上柱（1.5ml EP 管中處理）
液體樣本：血清、血漿、唾液、痰液、尿液、細胞培養(yǎng)病毒上清液等液體樣本直接吸取 150 μl 到 1.5ml EP 管中，并加入 120 μl RNALB1，漩渦混合均勻 10 秒。打開 1.5ml EP 管蓋，并加入 500 μl RNABB2 中，漩渦混合均勻 10 秒。倒入吸附柱中，13000 rpm 離心 30秒，倒掉過柱后的廢液，進行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
抗凝全血：直接吸取 150 μl 到 1.5 ml EP 管中，并加入 120 μl RNA
LB1，漩渦混合均勻 10 秒。打開 1.5 ml EP 管蓋，并加入 500 μl RNA
BB2 中，漩渦混合均勻 10 秒。13000 rpm 離心 30 秒后，將上清液倒入吸附柱中，13000 rpm 離心 30 秒，倒掉過柱后的廢液，進行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
固體樣本：組織、糞便等樣本。取 10~100 mg 固體材料樣本，加入到 300 μl RNA LB1 中（1.5ml EP 管），并加入幾粒鋼珠（一般3~4 粒），置于組織研磨儀中，研磨 1 分鐘。研磨完畢后，打開管
蓋，向勻漿液中加入 750 μl RNA BB2，并 13000 rpm 離心 1 分鐘。
打開管蓋，用 1 ml 吸頭吸取 750 μl 上清液到吸附柱中。13000 rpm離心 30 秒，倒掉過柱廢液，進行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
（2） 洗滌和洗脫
上述裂解/上柱操作完畢后，向吸附柱中加入 500 μl WashingBuffer，13000 rpm 離心 15 秒，并倒掉過柱廢液。重復此洗滌步驟一次。 將吸附柱重新放回離心機，13000 rpm 空離心 1min，將殘留的乙醇甩干。 將吸附柱芯放入到 1.5 mL Nuclease Free收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50 μl Nuclease Free H2O，室溫放置1 min，13,000rpm離心 1min，洗脫液即為提取的病毒RNA，冷凍保存。
特別說明：
（1）RNA LB1 和 RNA BB2 含有高鹽，在樣本加入到此溶液后，病毒會迅速滅活。同時此溶液對皮膚有腐蝕性，務必做好防護，如接觸到皮膚，用大量清水沖洗。
（2）樣本處理過程中的吸頭等材料可能含病毒分子，實驗完畢后務必妥善處理，不能隨意丟棄。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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