商品屬性：

產(chǎn)品介紹：
GST Magnetic Beads 是1μm大小均勻的，表面包覆有高密度谷胱的二氧化硅基質(zhì)超順磁磁珠。這種磁珠是特定設(shè)計主要用于免疫沉淀反應(yīng)，或者快速，一步法純化帶有 GST-標簽的重組蛋白，純化過程大約需要15-25分鐘。

產(chǎn)品特點：

·快捷，簡單的一步法高通量操作，無需純化柱或過濾器，或重復(fù)移液、離心等操作（圖 1）

·高結(jié)合能力

·極低的非特異性結(jié)合率

·成本低：只有市場同類磁珠產(chǎn)品價格的一半

·對樣本體積要求低，便于自動化操作


緩沖液成分：
·GST Magnetic Beads (懸浮在 0.05 M Na2HPO4, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.01% NaN3 緩沖液
中)
·1x Binding/Washing Buffer (0.14 M NaCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, pH 7.5)
·1x Elution Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)
注意事項: Dissolve 100 mg Glutathione (reduced) in 10 ml of 1x Elution Buffer. Prepare fresh. ·PBS Buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.5)
所需耗材
磁力分離器（適用于手動操作）：根據(jù)實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同
型號的磁力分離器：本公司 CZ402-01 可以容納 8 個單獨的 1.5 ml 離心管; CZ402-02 可
以容納 24 個單獨的 1.5 ml 離心管; CZ402-03 和 96 孔深孔板配合使用; CZ402-04 可以容
納 4 個單獨的 15 ml 離心管; CZ402-05 可以容納 4 個單獨的 50 ml 離心管。
操作過程
注意事項：
設(shè)計一個用于純化 DNA 或 RNA 的通用操作流程相對簡單，因為核酸具有相對一致
的生化特性。然而，設(shè)計一個用于蛋白質(zhì)純化的通用試劑盒是非常困難的，因為每種蛋白
質(zhì)具有不同的組成和結(jié)構(gòu)。為了獲得最佳實驗結(jié)果，每個用戶必須確定需要純化的融合蛋
白的最佳純化條件。
在純化 GST 標記的融合蛋白之前，應(yīng)將所需使用的試劑溫度調(diào)劑到室溫。
A．細胞提取物的制備去除上清后收集細胞體，并在-80℃下冷凍
放置 1 小時。
2. 在冰塊上解凍細胞，并且每 50 毫升細胞培養(yǎng)物用 3ml 的 1x Binding/ Washing Buffer 重
新懸浮細胞。在冰上通過短暫的超聲破碎細胞，直到樣品不再粘稠。同時避免樣品被加熱。
注意：GST 標簽與磁珠的結(jié)合不受 1% Triton X-100、1% Tween-20、1% CTAB、10 mM DTT、
0.03%SDS 或 0.1% NP-40 的影響。而且，這些化學(xué)物質(zhì)可能會減少非特異性結(jié)合概率。
3. 以 10000 x g 離心6分鐘，小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的預(yù)冷管中，并將沉淀按照每50ml
培養(yǎng)物加入 3ml 1x Binding /Wshing 緩沖液方式重新懸浮。
4. 分別從上清液和沉淀液中吸取 10μl 樣品，加入等體積的 2x SDS 加樣緩沖液， 煮沸 5
分鐘，使用 SDS-PAGE 測定融合蛋白的總量和溶解度。
注意：如果 GST 融合蛋白形成包涵體（不溶性蛋白），則包涵體必須在純化前適當(dāng)溶解和
重新折疊。
B．在自然條件下純化重組 GST 標簽融合蛋白
1. 震蕩裝有磁珠的試劑瓶，直到磁珠懸浮，然后將適量的磁珠轉(zhuǎn)移到新的試管中。
注意：這一點非常重要，用戶應(yīng)根據(jù)粗樣品中 GST 標記融合蛋白的數(shù)量，根據(jù)經(jīng)驗確定
用于每次純化的最佳磁珠數(shù)量。過多的磁珠會導(dǎo)致更高的背景；磁珠太少會導(dǎo)致產(chǎn)量下降。
所以，我們建議從每 0.1mg 重組 GST 標簽融合蛋白加 100μl 懸浮磁珠開始純化。
2. 將試管置于磁力分離器中，等待 2-3 分鐘，直到上清液澄清。吸出上清液，從磁力
分離器上取下管，用 4 倍體積的 1x Binding /Wshing 緩沖液重新懸浮磁珠。
3.重復(fù)步驟 2 一次。
4. 將試管放入磁力分離器中，待上清液澄清后丟棄上清液。用 1 倍體積的 1xBinding
/Wshing 緩沖液重新懸浮磁珠。
5. 將制備好的細胞提取物與磁珠混合，通過多次顛倒充分混合，并在連續(xù)旋轉(zhuǎn)的情況下混
勻 10-20 分鐘。將試管放入磁力分離器中，保存一小部分上清液并丟棄剩余部分。
注意：保留一份上清液供進一步分析，因為某些蛋白質(zhì)可能不會與磁珠結(jié)合。
6. 通過添加 8 倍體積的 1x Binding /Wshing 緩沖液清洗磁珠，并通過移液器多次吹吸重新
懸浮磁珠。再次將試管放入磁力分離器中，然后吸出試管上清液。
7. 用 8 倍體積的 1x Binding /Wshing 緩沖液充分清洗磁珠，直到洗脫液在 280 nm 處的
吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。（注意：這一步對于獲得高純度蛋白質(zhì)非常重要。）
8. 從磁力分離器上取下試管，向試管中加入所需體積的 1x Elution Buffer 緩沖液，從磁珠
上洗脫下結(jié)合蛋白。通過多次吹吸，將磁珠重新充分懸浮，并在室溫下渦旋震蕩 5 分鐘充
分混勻。將管放入磁力分離器中，小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。
9.重復(fù)步驟 8 一次。
10. 分別從上述步驟5 中吸取的上清液和步驟 8 中吸取的蛋白洗脫液中吸取 10-20μl 液體，
并進行 SDS-PAGE 分析，以確認目標蛋白的存在。
C．磁珠的再生和儲存
注意：如果目標 GST 融合蛋白相同，則磁珠可重復(fù)使用三次而無需再生。但是，如果目
標 GST 融合蛋白不同或磁珠結(jié)合能力下降，則必須根據(jù)以下條件再生磁珠：
1. 使用 10 倍體積的再生緩沖液 I (50 mM Tris-HCl，pH 8.0, 0.5 M NaCl)清洗磁珠，并用上
述的磁力分離器分離上清液。
2. 使用 10 倍體積的再生緩沖液 II (100 mM 醋酸鈉，pH 4.5, 0.5 M NaCl)清洗磁珠，并用
磁力分離器分離上清液。
3. 通過添加 10 倍體積的 1x Binding /Wshing 緩沖液，快速平衡磁珠。對于長期儲存，磁
珠應(yīng)儲存在 4oC 的 20%乙醇中。
D．常見問題
問題 1：純化的融合蛋白產(chǎn)率低或無法檢測到。
可能原因：
1. 重組蛋白形成包涵體
建議： ⑴在 14℃環(huán)境培養(yǎng)菌體。
⑵將 IPTG 的最終濃度降低至 0.1mM 以進行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)。 ⑶減少蛋白誘導(dǎo)時間。 ⑷純化前正確破碎包涵體。
2. 該融合蛋白不含有活性 GST 標簽
建議：嘗試使用其他融合蛋白的純化方式，例如 His 標簽。重新編碼目標蛋白的純化標簽。
3.過度的超聲破碎，使蛋白變性。 建議：盡量使用溫和的超聲波條件或其他方法。
4.融合蛋白不與磁珠結(jié)合
建議： ⑴在細胞裂解之前，在結(jié)合緩沖液中添加最終濃度為 5 mM 的 DTT。 ⑵ 檢查結(jié)合緩沖液的 pH 值（pH 值應(yīng)為 6.5-8.0）。
5. 融合蛋白不能有效地從磁珠中洗脫。
建議： ⑴提高洗脫時間。 ⑵將洗脫緩沖液中的谷胱肽濃度增加至 15mM 或更高。（請檢查最終 pH 值，必要時進行調(diào)整。）
⑶在不增加谷胱肽濃度的情況下，將洗脫緩沖液的 pH 值調(diào)整至 8.0-9.0。 ⑷在洗脫緩沖液中添加最終濃度為 0.1% Triton X-100 或最終濃度為 0.1-0.2 M NaCl。
問題 2. 在洗脫蛋白中觀察到多條帶可能原因：
1.融合蛋白降解
建議： ⑴添加適量的蛋白酶抑制劑。 ⑵使用蛋白酶缺陷表達宿主。
2. 一些宿主蛋白，如伴侶蛋白，可能與融合蛋白相互作用。
建議： ⑴在洗脫緩沖液中加入最終濃度為 5 mM DTT。 ⑵純化前，在 37℃下將重組蛋白溶液在伴侶蛋白緩沖液（2 mM ATP、10 mM MgSO4、50 mM Tris-HCl）中溫浴 10 min。
3. 過度超聲處理會導(dǎo)致一些蛋白質(zhì)與融合蛋白結(jié)合。
建議：使用溫和的超聲條件或其他溶解方法。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：