公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)，總蛋白的提取至關(guān)重要，如蛋白提取不好會(huì)導(dǎo)致后續(xù)試驗(yàn)的不理想甚至失敗，如：信號(hào)極弱或無(wú)雜交信號(hào)、背景高、非特異性條帶多等.根據(jù)目標(biāo)蛋白的類型和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用種類來(lái)選擇合適的RIPA裂解液，才能程度地保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功。 Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer對(duì)細(xì)胞有一定的裂解能力，能獲得較多的胞漿蛋白，而對(duì)細(xì)胞核的裂解能力有限，不能裂解細(xì)胞核，因此獲得的總蛋白適用于IP或CO-IP實(shí)驗(yàn)；而WB Super RIPA Lysis Buffer對(duì)動(dòng)物組織和細(xì)胞的裂解能力強(qiáng)，它可以裂解細(xì)胞核和線粒體，并可提取到更多的膜蛋白，從而可獲得更多的總蛋白。因其強(qiáng)的裂解能力，使得大量的基因組DNA從細(xì)胞核中釋放出來(lái)，使蛋白變的十分粘稠，使用Benzonase核酸酶消化可有效解決。經(jīng)RIPA裂解液獲得得蛋白可用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度；使用Bradford法測(cè)定由本裂解液裂解所得到樣品的蛋白濃度會(huì)稍有誤差。
1.可很好的釋放胞漿蛋白，部分釋放膜蛋白和核蛋白。 2.經(jīng)Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer，核蛋白與DNA還緊密 結(jié)合在一起，離心后會(huì)造成核蛋白的丟失。 3.對(duì)于膜蛋白，Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer的破壞力 小，不能使膜蛋白與膜充分分離，故離心后造成膜蛋白 的丟失。 4.在提取蛋白過(guò)程中，基因組DNA釋放使得蛋白提取液 變的十分粘稠，影響蛋白電泳和雜交效果。		1.可以很好的裂解細(xì)胞膜及細(xì)胞核，從而更好的釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白。 2.對(duì)于核蛋白，經(jīng)WB Super RIPA Lysis Buffer裂解后，核蛋白與粘稠的基因組DNA分離，離心后核蛋白存在于上清中，核蛋白的捕獲率高達(dá)90%。 3.對(duì)于膜蛋白，WB Super RIPA Lysis Buffer可大程度的破壞細(xì)胞膜和變性蛋白，使蛋白與膜分離，防止蛋白與膜復(fù)合物在離心后沉淀，從而防止蛋白丟失。 4.在提取蛋白過(guò)程中，基因組DNA釋放使得蛋白提取液變的十分粘稠，使用Benzonase核酸酶消化可有效解決。
儲(chǔ)存
置于室溫陰涼處，可保存2年。
實(shí)例
Fig.用WB Super RIPA Lysis Buffer和Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer分別提取核蛋白PPARγ和膜蛋白PLD-1，上樣量分別為40ug和10ug總蛋白，ECL發(fā)光液顯色。A/C泳道為WB Super RIPA Lysis Buffer，B/D泳道為Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer。由此圖比較分析表明WB Super RIPA Lysis Buffer能更充分的釋放核蛋白和膜蛋白，從而獲得更強(qiáng)的信號(hào)。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開(kāi)始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：